Pregabaline is geen GABAA- of GABAB-receptoragonist.
Pregabaline is een gabapentinoïde en werkt door bepaalde calciumkanalen te remmen. Het is specifiek een ligand van de aanvullende α2δ-subeenheidplaats van bepaalde spanningsafhankelijke calciumkanalen (VDCC's), en werkt daardoor als een remmer van α2δ-subeenheid-bevattende VDCC's. Er zijn twee geneesmiddelbindende α2δ-subeenheden, α2δ-1 en α2δ-2, en pregabaline vertoont een vergelijkbare affiniteit voor (en dus een gebrek aan selectiviteit tussen) deze twee plaatsen. Pregabaline is selectief in zijn binding aan de α2δ VDCC-subeenheid. Ondanks het feit dat pregabaline een GABA-analoog is, bindt het niet aan de GABA-receptoren, wordt het in vivo niet omgezet in GABA of een andere GABA-receptoragonist en moduleert het het GABA-transport of metabolisme niet direct. Er is echter gevonden dat pregabaline een dosisafhankelijke toename veroorzaakt in de hersenexpressie van L-glutaminezuurdecarboxylase (GAD), het enzym dat verantwoordelijk is voor de synthese van GABA, en kan daarom enkele indirecte GABAergische effecten hebben door de GABA-niveaus in de hersenen te verhogen. Er is momenteel geen bewijs dat de effecten van pregabaline worden gemedieerd door enig ander mechanisme dan remming van α2δ-bevattende VDCC's. Dienovereenkomstig lijkt remming van α2δ-1-bevattende VDCC's door pregabaline verantwoordelijk te zijn voor de anticonvulsieve, analgetische en anxiolytische effecten ervan.
De endogene α-aminozuren L-leucine en L-isoleucine, die qua chemische structuur sterk lijken op pregabaline en de andere gabapentinoïden, zijn schijnbare liganden van de α2δ VDCC-subeenheid met vergelijkbare affiniteit als de gabapentinoïden (bijv. IC50 = 71 nM voor L- isoleucine), en zijn aanwezig in menselijk hersenvocht in micromolaire concentraties (bijv. 12,9 μM voor L-leucine, 4,8 μM voor L-isoleucine). Er wordt getheoretiseerd dat dit de endogene liganden van de subeenheid kunnen zijn en dat ze de effecten van gabapentinoïden competitief kunnen tegenwerken. Hoewel gabapentinoïden zoals pregabaline en gabapentine nanomolaire affiniteiten hebben voor de α2δ-subeenheid, liggen hun potenties in vivo in het lage micromolaire bereik, en wordt gezegd dat concurrentie om binding door endogene L-aminozuren waarschijnlijk verantwoordelijk is voor deze discrepantie.

In één onderzoek bleek pregabaline een zesmaal hogere affiniteit te bezitten dan gabapentine voor α2δ-subeenheidbevattende VDCC's. Uit een ander onderzoek bleek echter dat pregabaline en gabapentine vergelijkbare affiniteiten hadden voor de menselijke recombinante α2δ-1-subeenheid (respectievelijk Ki = 32 nM en 40 nM). In ieder geval is pregabaline 2 tot 4 keer krachtiger dan gabapentine als analgeticum en lijkt het bij dieren 3 tot 10 keer krachtiger te zijn dan gabapentine als anticonvulsivum.