Pregabaline is geen GABAA- of GABAB-receptoragonist.
Pregabaline is een gabapentinoïde en werkt door remming van bepaalde calciumkanalen.Het is met name een ligand van de hulp-α2δ-subeenheidplaats van bepaalde spanningsafhankelijke calciumkanalen (VDCC's), en werkt daardoor als een remmer van α2δ-subeenheid-bevattende VDCC's.Er zijn twee geneesmiddelbindende α2δ-subeenheden, α2δ-1 en α2δ-2, en pregabaline vertoont een vergelijkbare affiniteit voor (en dus gebrek aan selectiviteit tussen) deze twee plaatsen.Pregabaline is selectief in zijn binding aan de α2δ-VDCC-subeenheid.Ondanks het feit dat pregabaline een GABA-analoog is, bindt het niet aan de GABA-receptoren, wordt het in vivo niet omgezet in GABA of een andere GABA-receptoragonist en moduleert het het GABA-transport of -metabolisme niet direct.Er is echter gevonden dat pregabaline een dosisafhankelijke toename veroorzaakt in de hersenexpressie van L-glutaminezuurdecarboxylase (GAD), het enzym dat verantwoordelijk is voor de synthese van GABA, en kan daarom enkele indirecte GABA-erge effecten hebben door de GABA-niveaus in de hersenen te verhogen.Er is momenteel geen bewijs dat de effecten van pregabaline worden gemedieerd door een ander mechanisme dan remming van α2δ-bevattende VDCC's.In overeenstemming lijkt remming van α2δ-1-bevattende VDCC's door pregabaline verantwoordelijk te zijn voor de anticonvulsieve, analgetische en anxiolytische effecten.
De endogene -aminozuren L-leucine en L-isoleucine, die qua chemische structuur sterk lijken op pregabaline en de andere gabapentinoïden, zijn schijnbare liganden van de α2δ VDCC-subeenheid met vergelijkbare affiniteit als de gabapentinoïden (bijv. IC50 = 71 nM voor L- isoleucine), en zijn aanwezig in menselijke cerebrospinale vloeistof in micromolaire concentraties (bijv. 12,9 M voor L-leucine, 4,8 M voor L-isoleucine).Er is getheoretiseerd dat ze de endogene liganden van de subeenheid kunnen zijn en dat ze competitief de effecten van gabapentinoïden kunnen tegenwerken.In overeenstemming, terwijl gabapentinoïden zoals pregabaline en gabapentine nanomolaire affiniteiten hebben voor de α2δ-subeenheid, ligt hun potentie in vivo in het lage micromolaire bereik, en er wordt gezegd dat competitie voor binding door endogene L-aminozuren waarschijnlijk verantwoordelijk is voor deze discrepantie.

In één onderzoek bleek pregabaline een 6 keer hogere affiniteit te hebben dan gabapentine voor α2δ-subeenheid-bevattende VDCC's.Uit een ander onderzoek bleek echter dat pregabaline en gabapentine vergelijkbare affiniteiten hadden voor de menselijke recombinante α2δ-1-subeenheid (Ki = respectievelijk 32 nM en 40 nM).In elk geval is pregabaline 2 tot 4 keer krachtiger dan gabapentine als analgeticum en lijkt het bij dieren 3 tot 10 keer krachtiger te zijn dan gabapentine als anticonvulsivum.